Геномный анализ примитивных, диких и культивируемых цитрусовых дает представление о бесполом размножении

1. Citrinae филогения и репродуктивные системы Консервативные монопенные гены из восьми видов Citrinae...
2. Геномная характеристика цитрусовых
3. Генетическое разнообразие и сравнительный популяционный анализ
4. Геномная основа цитрусового апомиксиса (ядерная полиэмбриония)
5. Транскриптом половых и ядерных эмбрионов из цитрусовых

Citrinae филогения и репродуктивные системы

Консервативные монопенные гены из восьми видов Citrinae были использованы для построения филогенетического дерева ( Рис. 1а ). Как и ожидалось, первобытный цитрусовый Atalantia находился в базальном положении на дереве. Колючий и дикий вид Citrus ichangensis (Ichang papeda, далее именуемый papeda) филогенетически расположен между примитивным и культивируемым цитрусовым. Три основных вида, C. reticulata (мандарин), C. grandis (пуммело) и C. medica (цитрон), показали близкие отношения друг с другом. Примитивные, дикие и культивируемые цитрусовые имеют по девять гаплоидных хромосом ( Дополнительный рис. 1 ). Цитрусовые виды проявляют широкую сексуальную совместимость. Межвидовые и межродовые гибридизации возможны даже между примитивными и культивируемыми цитрусовыми 17 , Наши эксперименты также подтверждают совместимость прививки и частичную сексуальную совместимость аталантии и цитрусовых ( Дополнительный рис. 2 ). Аталантия и папеда в основном размножаются семенами, с большими или многими семенами, которые в основном заполняют локусы плода ( Рис. 1б ) и не пригодны для размножения прививкой из-за сильных и многочисленных колючек и жестких веточек ( Дополнительный Рис. 3 ). В противоположность этому вегетативный пропагул, который способствует размножению прививкой, имеет идеальную морфологию в мандарине, пуммело, сладком апельсине и других культивируемых цитрусовых ( Дополнительный Рис. 3 ).

Рисунок 1: Филогения, геномы, фрукты и семена примитивных, диких и культивируемых цитрусовых.

( а ) Citrinae филогения и геномы. Филогенетическое дерево было построено с использованием метода максимального правдоподобия. Звездочки обозначают геномы de novo, секвенированные в этом исследовании. Круги обозначают ранее опубликованные геномы. Фиолетовый указывает на примитивные цитрусовые; зеленый цвет обозначает дикие цитрусовые; коричневый цвет указывает на три основных вида цитрусовых. Значения начальной загрузки> 60 указаны. ( б ) Различия между фруктами и семенами примитивных, диких и культивируемых цитрусовых. Показаны сечения молодых (слева) и зрелых (справа) плодов разных видов. Длина каждой линии основана на процентном содержании семян в плодах. Шкала баров, 1 см.

Качественный и три черновых генома Citrinae

Высококачественный геном цитрусовых был получен из гаплоидного пуммело ( Дополнительный Рис. 4 ) путем секвенирования одной молекулы. Для сборки генома было использовано 56,8-кратное покрытие одномолекулярных последовательностей на платформе PacBio RS II с использованием дробовика ( Дополнительная таблица 1 ). Кроме того, 370,3 × данные секвенирования Illumina были использованы для исправления ошибок секвенирования и для заполнения пробелов ( Дополнительный Рис. 5 а также Дополнительная таблица 2 ). Контиг N50 и N90 финальной сборки составлял 2,2 Мб и 70 кб соответственно. Более того, каркасы N50 и N90 были 4,2 Мб и 565 кб соответственно ( Таблица 1 ). Смежность последовательностей представляет собой 18-кратное и 44-кратное улучшение геномов C. clementina и C. sinensis , соответственно, согласно оценке contig N50 (refs. 18 , 19 ). Девяносто процентов сборки находится в 101 каркасе размером более 565 кб. Самый большой эшафот - 14,3 Мб. В общей сложности 117 каркасов, на которые приходится 87% собранного генома, были закреплены 1563 молекулярными маркерами ( Дополнительные рис. 6 а также 7 а также Дополнительная таблица 3 ).

Таблица 1: Статистика сборки генома гаплоидного пуммело

Три черновых генома гетерозиготных видов Citrinae - atalantia ( A. buxifolia , примитивный цитрус), папеда ( C. ichangensis , дикий цитрус) и цитрон ( C. medica ) ( Рис. 1а ) - были секвенированы и собраны с последовательными считываниями ружья Illumina. Данные секвенирования с высоким охватом, которые варьировались от 164,4 × до 401,9 ×, были получены из нескольких библиотек, с небольшими размерами вставок, которые варьировались от 140 до 500 пар оснований, и с размерами длинных вставок 2, 5 и 20 КБ ( Дополнительные таблицы 4–6 ). Последовательные чтения были собраны с использованием алгоритма графа де Брейна из пакета SOAPdenovo 20 , что приводит к значениям каркаса N50 1074 кб, 504 кб и 367 кб (при значениях contig N50 23,9 кб, 76,6 кб и 46,5 кб) для аталантии, папеды и цитрона соответственно ( Дополнительная таблица 7 ).

Для предсказания генома пуммело были интегрированы программы предсказания гена ab initio , поиски гомологии и анализ РНК-секвенирования. Мы идентифицировали 30 123 белка-кодирующих гена с 42 886 транскриптами. Транскрипты гена имели среднюю длину 1572 п.н., средний размер кодирующей последовательности 1141 п.н. и среднюю длину экзона 277 п.н. Данные RNA-seq показали, что 12 763 генных локусов (42,4%) кодируют две или более изоформ транскрипции. Что касается ядра и необязательных частей этих геномов, то все гены в шести геномах (29 655 в сладком апельсине; 24 533 в мандарине клементина; 30 123 в пуммело; 32 579 в цитроне; 32 067 в папеде; 28 420 в аталанции) ( Дополнительная таблица 7 ) были классифицированы на 23 829 семейств генов на основе гомологии их кодируемых белков. В общей сложности 12457 (52%) семейств генов были распределены между всеми шестью из этих геномов ( Дополнительный Рис. 8 а также Дополнительная таблица 8 ). Дальнейший анализ показал сходное количество генов почти во всех семействах генов транскрипционных факторов в шести цитрусовых геномах ( Дополнительные таблицы 9 а также 10 ).

Геномная характеристика цитрусовых

Четыре секвенированных вида из этого исследования (аталантия, папеда, цитрон и пуммело) и два ранее опубликованных секвенированных вида (сладкий апельсин и мандарин клементина) 18 , 19 варьируются от примитивных до культивируемых цитрусовых ( рисунок 1 ). Обзор синтении генома и вариации последовательности представлен в фигура 2 а также Дополнительные рисунки 9–13 , Размеры генома одинаковы среди видов цитрусовых . Мы наблюдали наибольшее изменение размера генома между Atalantia и видами цитрусовых ( Дополнительная таблица 11 а также Дополнительное примечание 2 ). На основании нашего анализа наличия-отсутствия-вариации (PAV), 33,28% уникальных областей в пуммело (относительно аталантии) содержали переносимые элементы (TE), а 2,68% уникальных областей содержали кодирующие белки гены ( Дополнительная таблица 12 ). Приблизительно одна пятая часть генов в уникальных областях (153 из 780 аннотированных генов) пуммело, как было предсказано, имела известные функции. Эти гены были значительно обогащены (значение P <0,05 и FDR <0,05) в трех терминах GO: защитный ответ и протеолиз (категория биологического процесса) и активность пектат-лиазы (категория молекулярной функции) по отношению ко всему геному pummelo ( Дополнительный Рис. 14 ). Из 153 генов с функциональными аннотациями 93 гомологичны одному или нескольким генам (60,78%) ( Дополнительная таблица 13 ). И наоборот, уникальные районы в аталансии относительно pummelo имели более высокое содержание TE (54,20%), чем весь геном аталансии (43,55%).

Рисунок 2: Характеристики цитрусовых геномов.

Показано распределение областей синтения и достоверных SNV между геномом pummelo и тремя геномами, представляющими культивируемый, дикий и примитивный цитрусовые. Линии в центре круга указывают пары гомологичных генов на разных хромосомах пуммело.

SNV были достоверно идентифицированы путем выравнивания последовательностей ( Дополнительный Рис. 15 ) и отфильтрованы с использованием данных повторного упорядочения. Попарное сравнение каждого вида с pummelo показало, что отношения переход / трансверсия варьировались от 1,38 до 1,66, в среднем 1,57 ( Дополнительная таблица 14 ). Распределения SNV в генных структурах показали наибольшую плотность в 5 ′ и 3 ′ UTRs (в среднем 18.8 и 17.2 SNV на килобайт для 5 ′ и 3 ′ UTR соответственно). Второе место по плотности SNV было в интронах (в среднем 14,2 SNV на килобайт). Самая низкая плотность SNV была в областях кодирующей последовательности (CDS) (в среднем 9,7 SNV на килобайт) ( Дополнительная таблица 15 ).

Отношение несинонимичных к синонимичным заменам (dN / dS) рассчитывали для каждого из 8551 ортопедического экземпляра в единственном экземпляре, разделяемого этими шестью цитрусовыми геномами. Мы обнаружили, что 207, 100, 104, 66, 106 и 77 генов показали более высокие значения dN / dS в аталантии, папеде, цитроне, пуммело, мандарине клементина и сладком апельсине ( Дополнительная таблица 16 ) соответственно по отношению к другим видам. Для dN / dS однокопийных ортологичных генов 12,79% генов показали значение, большее, чем у аталанций ( Дополнительная таблица 17 ). Эта доля была выше, чем среднее значение 6,82% от других цитрусовых ( Дополнительные таблицы 18–22 ), что указывает на большее расхождение последовательности в аталанции по сравнению с другими цитрусовыми. Эти гены могут иметь функциональные ассоциации с биологическими особенностями аталантии. Например, Cg4g018790 кодирует цитокининоксидазу / дегидрогеназу, гомологичную гену риса OsCKX2 , который, как сообщалось, контролирует количество семян 21 , В этом гене полиморфизмы более высокой последовательности наблюдались при аталансии по сравнению с другими видами цитрусовых ( Дополнительный Рис. 16 ).

Генетическое разнообразие и сравнительный популяционный анализ

Виды Citrinae демонстрируют высокий уровень морфологического разнообразия ( Рис. 3а ), что является отражением их разнообразного генетического происхождения. Мы отобрали и упорядочили 100 цитрусовых образцов со средней глубиной 30-кратного охвата генома ( Дополнительная таблица 23 ). Секвенирование данных из трех мандаринов, одного апельсина и четырех пуммело из предыдущих исследований 18 , 19 были также проанализированы. Этот набор из 108 цитрусовых образцов ( Дополнительный Рис. 17 ) был использован для анализа разнообразия популяций, анализа генетической дифференциации и анализа ассоциации признака апомиксиса. Для сравнительного анализа популяции были использованы 15 образцов аталантии, 11 образцов папеды и 19 образцов пуммело, представляющих примитивные, дикие и культивируемые цитрусовые ( Рис. 3б а также Дополнительный Рис. 18 ). Значения индекса фиксации ( F ST) среди этих цитрусовых популяций колебались около 0,28 ( Дополнительный Рис. 19 ), что указывает на умеренную генетическую дифференциацию среди популяций цитрусовых. Для сравнения, F ST составляло 0,34 между двумя дикими популяциями обыкновенных бобов и 0,44 между дикими и культивируемыми огурцами. 22 , 23 ,

Рисунок 3: Анализ генетического разнообразия и популяционной дифференциации примитивных, диких и культивируемых цитрусовых.

( а ) Разнообразие зародышевой плазмы цитрусовых в этом исследовании. Внутренний круг, примитивные цитрусовые; средний круг, дикие и культивируемые цитрусовые; Внешний круг, культивируемые цитрусовые. ( b ) Филогенетическое древо с максимальным правдоподобием из 45 цитрусовых образцов (15 аталантов, 11 папед и 19 пуммело), ​​использованных в сравнительном популяционном анализе. Значения начальной загрузки указаны в дереве. ( c ) Распределение π вдоль хромосом среди популяций аталантии, папеды и пуммело соответственно. Эти значения были рассчитаны в скользящих окнах по 2 Мб с шагом 1 Мб. ( d ) Распределение сокращения разнообразия (log 10 π отношений) и дифференциации (значения F ST) из парного сравнения популяций аталантии и пуммело. π отношения были рассчитаны как πatalantia / πpummelo в скользящих окнах по 50 Кб с шагом 10 Кб. Область над пунктирной линией в распределении отношений log10 π соответствует 5% правому хвосту эмпирического распределения (отношение log10 π = 0,36). Области над пунктирной линией в распределении значений F ST находятся в 5% -ном правом хвосте эмпирического распределения ( F ST составляет 0,40).

Анализ нуклеотидного разнообразия (π) показал, что аталанция обладает самым высоким генетическим разнообразием и что папеда имеет более высокий уровень генетического разнообразия, чем пуммело ( Рис. 3с ). Мы наблюдали резкое сокращение генетического разнообразия между аталанцией и папедой. Дополнительный анализ последовательности показал, что аталанция имеет более сильно расходящиеся области (в среднем в три раза более сильно расходящиеся области), чем две другие популяции ( Дополнительная таблица 24 ). Например, длинный участок в конце хромосомы 5 (39,64–49,38 Мб, около одной пятой хромосомы) показал наибольшее разнообразие в аталанции и резкое сокращение разнообразия в папеде и пуммело ( Рис. 3с ).

Геномные районы, которые демонстрировали как высокую дифференциацию, так и пониженное разнообразие, были идентифицированы среди примитивных, диких и культивируемых цитрусовых ( Дополнительный Рис. 20 а также Дополнительные таблицы 25–27 ). Результаты парных сравнений показали, что распределение таких областей по хромосомам было неравномерным ( Рис. 3d а также Дополнительный Рис. 21 ). На основании парного сравнения между аталантией и пуммело мы пришли к выводу, что в пуммело, вероятно, отбиралось в общей сложности 18,1 Мб геномных областей, содержащих 2430 генов ( Рис. 3d а также Дополнительная таблица 28 ). Эти области включают гены, связанные с вегетативным ростом, такие как Cg7g021010, Cg4g017400 и Cg9g010410 , которые гомологичны TCP15 (ref. 24 ), ЛАГ 25 и YUCCA3 (исх. 26 ) соответственно ( Дополнительный Рис. 22 ). Примечательно, что мы наблюдали сильный сигнал на хромосоме 9, охватывающий 220 кб, от 13,8 до 14,0 мб ( Рис. 3d а также Дополнительный Рис. 23 ) в геноме пуммело. Тринадцать из пятнадцати аннотированных генов в этом регионе имеют функции, связанные с биогенезом цитохрома с , митохондриальными белками, АТФ-синтазой, NADH-дегидрогеназой и митохондриальными рибосомными белками ( Дополнительная таблица 25 ). Сравнительный анализ также показал, что гены, связанные с цветением, такие как ген, кодирующий гомеобокс, связанный с WUSCHEL (WOX) 27 фактор транскрипции ( Cg4g011660 ; Дополнительный Рис. 24 ) и ген, кодирующий белок управления временем цветения FPA ( Cg2g027110 ; Дополнительный Рис. 25 ), показали сильно уменьшенное разнообразие и высокую степень дифференциации. Поэтому мы предполагаем, что эти гены, вероятно, находились в стадии отбора. Эти регионы, как было показано в последних исследованиях, содержат сигналы отбора. 22 , 28 , Эффект, вызванный другими возможностями, такими как генетический дрейф и узкие места 29 , не может быть исключен, но может быть ограничен, о чем свидетельствует аналогичная попарно-последовательная кривая Марковского слияния (PSMC) этих трех популяций ( Дополнительный Рис. 26 ). FPA играет решающую роль в регуляции времени цветения у арабидопсиса 30 , Этот вывод согласуется с наблюдением, что аталанция имеет продолжительный сезон цветения (с мая по декабрь) и что, напротив, сезон цветения синхронизирован среди всех других культивируемых цитрусовых.

Геномная основа цитрусового апомиксиса (ядерная полиэмбриония)

Появление особого типа апомиксиса, nucellar polyembryony у мандарина и большинства культивируемых сортов цитрусовых является одной из характерных черт недавней эволюции цитрусовых ( Рис. 4а ). Мы оценили фенотипы полиэмбрионии 124 плодоносящего потомства из сегрегирующей популяции, полученной из скрещивания между HB pummelo (моноэмбриония) и мандарином Fairchild (полиэмбриония), которые демонстрировали контрастные фенотипы ( Дополнительная таблица 29 ). Для анализа объемного сегрегации (BSA) преобразованный Δ (индекс SNP) рассчитывали и наносили на график в зависимости от геномной последовательности в скользящих окнах по 250 кб с размерами шагов 10 кб ( Рис. 4б ). Пиковое значение для трансформированного Δ (индекс SNP) было локализовано в области, охватывающей от 23,695 до 25,655 Мб на хромосоме 4. Эти данные указывают на то, что в этом 1,96-мб регионе находится главный локус, способствующий нуклеточной полиэмбрионии.

Рисунок 4: Генетическое картирование цитрусовой полиэмбрионии.

( а ) Фенотип цитрусовой полиэмбрионии. ( б ) Картирование полиэмбрионии методом массового сегрегации (BSA) сегрегирующей популяции, полученной из скрещенных мандаринов HB pummelo × Fairchild. Красная стрелка указывает положение пика 1,96 Мб. Преобразованное Δ (индекс SNP) является произведением Δ (индекс SNP) и нормализованной плотности SNP в каждом скользящем окне объемом 250 КБ (с шагом 10 КБ). ( c ) Анализ местных ассоциаций на основе генов в соответствующем регионе. Вверху, тепловая карта для уровней ассоциации в соответствующем регионе. Преобразованный -log10 P (точный критерий Фишера с двумя хвостами) рассчитывался в каждом скользящем окне по 50 КБ (с шагом 10 КБ). Средний, регион-кандидат в 80 кб с самой сильной ассоциацией. Линия регрессии (красная) и доверительные интервалы (серая) были рассчитаны с использованием линейной модели с уровнем достоверности 0,95. Внизу, гены в области кандидата в диплоидных пуммело. Коробки представляют гены; горизонтальная черная линия представляет межгенные районы; вертикальные линии показывают положения 5'-конца генов. Гены, аннотированные из генома гаплоидного пуммело, представлены в Дополнительный рисунок 28 ,

Для точного сопоставления полиэмбрионального локуса был проведен анализ локальной ассоциации с информацией о вариантах от генов, кодирующих белок в области 1,96 Мб, с использованием данных секвенирования генома из 108 вышеупомянутых образцов, включая 45 полиэмбриональных и 63 моноэмбриональных образцов ( Дополнительная таблица 23 ). Мы использовали значения P из точного критерия Фишера для измерения корреляции между изменением нуклеотидов и фенотипом ( Дополнительный Рис. 27 ), которые были скорректированы с поправкой на ложную скорость обнаружения (FDR) для множественного тестирования. Этот анализ локализовал локус полиэмбрионии в области размером ~ 80 т.п.н. на хромосоме 4, между 24,54 и 24,62 Мб, которая содержит 11 генов ( Рис. 4с а также Дополнительный Рис. 28 ). В соответствии с этим результатом популяционная дифференциация между полиэмбриональными и моноэмбриональными образцами была значительно выше для этого региона размером 80 т.п.н., чем для окружающих регионов ( Дополнительный Рис. 29 ). Неравновесное сцепление (LD) среди полиэмбриональных образцов было больше, чем LD среди моноэмбриональных образцов ( Дополнительный Рис. 29 ), что указывает на селекционную сигнатуру между моноэмбриональным и полиэмбриональным цитрусовыми.

Среди 11 кандидатов в гены Cg4g018910 и Cg4g018970 показали наибольшую связь с фенотипом полиэмбрионии ( Рис. 5а ). Анализ экспрессии всех генов-кандидатов показал, что Cg4g018970 был высоко экспрессирован в яйцеклетках и специфически экспрессирован в полиэмбриональных сортах цитрусовых, но не в моноэмбриональных сортах цитрусовых ( Рис. 5б, в а также Дополнительный Рис. 30 ). Cg4g018970 кодирует белок, содержащий домен RWP -RK, сходный с белком семейства Arabidopsis RKD, которые служат регуляторами генов, связанных с яйцеклеткой 31 , Таким образом, в дальнейшем мы будем ссылаться на Cg4g018970 как CitRWP . Выравнивание последовательностей CitRWP из полиэмбриональных и моноэмбриональных цитрусовых идентифицировало четыре SNP в последовательности гена и вставку миниатюрного TE-инвертированного повтора (MITE) в область промотора (g.24610316_24610317ins (203) в хромосоме 4 в ссылке на геном pummelo (MKYQ00000000)) ( Рис. 5г а также Дополнительный Рис. 31 ). Чтобы проверить, связан ли этот транспозон с локусом полиэмбрионии, мы провели скрининг 124 плодоносящих особей из сегрегирующей популяции 217 потомства, полученной из скрещенных мандаринов HB pummelo × Fairchild. Мы не обнаружили эту вставку MITE ни в одном из моноэмбрионального потомства ( n = 66). Напротив, мы обнаружили вставку MITE во всех полиэмбриональных потомствах ( n = 58) ( Дополнительный Рис. 32 ). Таким образом, мы заключаем, что эта вставка MITE связана с локусом полиэмбрионии. Затем мы использовали коллекцию зародышевой плазмы, содержащую 786 образцов цитрусовых, для независимой проверки этой ассоциации. В соответствии с нашими результатами мы обнаружили эту вставку MITE во всех полиэмбриональных образцах ( n = 213). Напротив, все моноэмбриональные образцы ( n = 573) не имеют этой конкретной вставки MITE ( Рис. 5e, f а также Дополнительная таблица 30 ).

Рисунок 5: Гены-кандидаты, связанные с полиэмбрионией цитрусовых.

( a ) Пчелиный теплоту и коробчатый график для ассоциированных SNP в 11 генах-кандидатах. Точки в разных цветах представляют связанные SNP в соответствующей последовательности гена. Боксы, средний и межквартильный размах; усы максимальные и минимальные значения. ( б ) Относительная экспрессия CitRWP, определенная с помощью qRT-PCR в различных тканях сладкого апельсина. Данные имеют среднее значение ± стандартное отклонение; n = 3 технических копии 2 объединенных образцов ткани. ( c ) qRT-ПЦР-подтверждение экспрессии CitRWP в яйцеклетках моноэмбриональных сортов (PML, pummelo; CTR, цитрон; CLM, мандарин клементин) и полиэмбриональных сортов (GRP, грейпфрут; LM, лимон; PK, ponkan). Данные имеют среднее значение ± стандартное отклонение; n = 3 технических копии 2 объединенных образцов ткани. ( d ) Принципиальная схема CitRWP . Звездочки обозначают позиции SNP, связанных с полиэмбрионией; треугольник указывает на вставку MITE; оранжевые прямоугольники указывают на экзоны. ( e ) Репрезентативное обнаружение вставок MITE на основе ПЦР в сортах цитрусовых. ( f ) ПЦР-анализ инсерции MITE в 786 цитрусовых образцах и сегрегирующей популяции F1, полученной из скрещивания HB pummelo (HB) × Fairchild mandarin (FC).

Транскриптом половых и ядерных эмбрионов из цитрусовых

Чтобы исследовать молекулярные процессы и гены, вовлеченные в половой и нуклеточный эмбриогенез в цитрусовых, мы сравнили данные RNA-seq, полученные из листьев, яйцеклеток, плодов и семян пуммело (половой тип) и сладкого апельсина (бесполый тип). Мы обнаружили, что 1637 и 1840 генов были высоко экспрессированы в яйцеклетках (в ≥2 раза выше, чем в других тканях) пуммело и сладкого апельсина соответственно ( Рис. 6а а также Дополнительные таблицы 31 а также 32 ). Мы обнаружили, что 853 из этих генов были высокоэкспрессированы как в пуммело, так и в сладком апельсине. Анализ генной онтологии (GO) показал, что гены, связанные с движением на основе микротрубочек, упаковкой ДНК, клеточным циклом, репликацией ДНК, митозом и активностью регулятора транскрипции, были перепредставлены среди генов, которые были высоко экспрессированы в яйцеклетках ( Дополнительная таблица 33 ). Гены, которые были высокоэкспрессированы в яйцеклетках сладкого апельсина, были значительно (P <0,05; FDR <0,05) обогащены почти теми же онтологиями генов, что и группа из 853 генов, которые были высоко экспрессированы в яйцеклетках как пуммело, так и сладкого апельсина, такие как регуляция транскрипции, митоза, ядерного деления и митотического клеточного цикла, которые способствуют клеточному делению ( Дополнительная таблица 34 ). Эти данные подчеркивают сходство транскриптомов нуклеточных и половых эмбрионов.

Рисунок 6: Сравнительный транскриптомный анализ моноэмбриональных и полиэмбриональных цитрусовых.

( а ) Тепловая карта генов, которые специфически экспрессируются в яйцеклетках как пуммело (моноэмбриония), так и сладкого апельсина (полиэмбриония). Для сравнительного анализа использовали листья, яйцеклетку, плодовые и семенные ткани из пуммело (нечетные числа) и сладкого апельсина (четные числа). ( б ) Тепловая карта генов со значительно отличающейся экспрессией в яйцеклетках моноэмбриональных (PML, pummelo; CTR, цитрон; CLM, клементин мандарин) и полиэмбриональных сортов (GRP, грейпфрут; LM, лимон; PK, ponkan). Данные получены из 2 копий растительной ткани. Нормализованные значения FPKM после масштабирования и центрирования показаны. ( c ) Модель для генов, которые участвуют в моноэмбрионии и полиэмбрионии, включая ген кандидата CitRWP (желтая звезда). Синие точки указывают на гены, высоко экспрессируемые в яйцеклетках и не демонстрирующие значительного различия в экспрессии между моноэмбриональными и полиэмбриональными сортами цитрусовых ( Дополнительные таблицы 36 а также 37 ). Красные точки указывают на гены, высоко экспрессированные в яйцеклетках полиэмбриональных сортов цитрусовых. М - материнская клетка мегаспоры; ES, эмбриональный мешок; N, клетка инициации нуклеарного эмбриона.

Для выявления генов, которые дифференциально экспрессируются между полиэмбрионией и моноэмбрионией, был проведен сравнительный транскриптомный анализ на семяпочках из трех пар моноэмбриональных и полиэмбриональных сортов цитрусовых (пуммело-грейпфрут, цитрон-лимон, клементин-понкан) на ключевой стадии эмбриона ядер инициация (т. е. за 3 дня до антаза) 14 , 15 , Учитывая генетические различия между каждой парой сортов цитрусовых, мы провели парное сравнение данных трех пар RNA-seq. Среди 2624 генов, которые были преимущественно экспрессированы в яйцеклетках пуммело и сладкого апельсина, 29 показали заметно разные (в 2 раза) уровни экспрессии между каждой парой моноэмбриональных и полиэмбриональных сортов ( Рис. 6б а также Дополнительная таблица 35 ). Аннотации этих генов и анализ гомологичных последовательностей Arabidopsis показали, что 11 из 29 генов кодируют белки с неизвестной функцией. Почти половина оставшихся генов были связаны с биологическими процессами реакции на стресс ( RNS1, ATSOD1, Cg4g011120 и Cg9g004560 ) и окисления ( ATBBE18 и Cg3g004030 ). Три дополнительных гена ( EDA24, AGL2 и ACR4 ) способствуют развитию цветов и эмбрионов у арабидопсиса и других растений. 32 , 33 , 34 , Эти гены экспрессируются в яйцеклетках как моноэмбриональных, так и полиэмбриональных сортов и экспрессируются на значительно более высоких уровнях у полиэмбриональных сортов. CitRWP демонстрирует сходную тенденцию экспрессии у полиэмбриональных сортов, что согласуется с нашим выводом из генетического анализа, что CitRWP является ключевым кандидатом-геном, контролирующим полиэмбрионию ( Рис. 6с а также Дополнительные таблицы 36 а также 37 ).

Похожие

Комментарии