Полиэмбрионы в неапомиктичных цитрусовых генотипах

1. Аннотация История вопроса и цели
2. методы
3. Ключевые результаты
4. Выводы
5. ВСТУПЛЕНИЕ
6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
7. Опыление и спасение эмбрионов
8. Гибридизация 2 х × 2 х
9. Опыление и нуклеточная культура in vitro
10. Перенос в почву
11. Анализ на уровне плоидности
12. Генетический анализ
13. Гистологическая характеристика
14. ОБСУЖДЕНИЕ
15. Множественные эмбрионы, полученные в неразвитых семенах в результате гибридизации диплоидных неапомиктических...
16. Семенная полиэмбриония неапомиктических цитрусовых генотипов специфически индуцируется путем опыления...
17. Растения, извлеченные культурой nucellus in vitro из неапомиктических цитрусовых генотипов, представляют...
18. Приключенческая полиэмбриония в неапомиктичных генотипах цитрусовых
19. Практическое значение для селекции и очистки цитрусовых
20. Выводы

Аннотация

История вопроса и цели

Случайный эмбрион из клеток nucellar является механизмом, приводящим к апомиксису у Citrus sp. Тем не менее, единичные случаи полиэмбрионии были зарегистрированы в неапомиктичных генотипах вследствие 2х × 4х гибридизации и культивирования in vitro изолированных ядер. Происхождение растений в результате вышеупомянутых процессов остается неясным.

методы

Генетическая структура (плоидность и аллельное строение с микросателлитными маркерами) растений, полученных из полиэмбриональных семян, полученных в результате 2 × 4- х половых гибридизаций, и растений, регенерированных из культуры nucellus in vitro, систематически анализировалась в различных неапомиктических генотипах цитрусовых. Гистологические исследования также проводились с целью выявления процесса инициации, лежащего в основе полиэмбрионии.

Ключевые результаты

Все растения, полученные из одного и того же неразвитого семени в 2 × 4 гибридизации, произошли в результате расщепления исходного зиготического зародыша. Кроме того, растения, полученные из культуры nucellus in vitro, были получены соматическим эмбриогенезом из клеток, которые имели тот же генотип, что и зиготические зародыши того же семени.

Выводы

По-видимому, в неапомиктичных генотипах цитрусовых проэмбрио или эмбриогенные клетки образуются в результате расщепления зиготических зародышей и что развитие этих случайных зародышей, обычно затрудненных, может происходить in vivo или in vitro в результате двух различных механизмов, которые предотвратить доминирование первоначального зиготического зародыша.

Ключевые слова: цитрус , полиэмбриония, апомиксис, расщепление эмбрионов, ядро, межплоидная гибридизация.

ВСТУПЛЕНИЕ

Феномен полиэмбрионии был обнаружен Левенгуком в 1719 году, который наблюдал образование двух проростков из одного и того же семени цитрусовых ( Батыгина и Виноградова, 2007 ). Потом, Страсбургер (1878) сообщили о формировании адвентивных эмбрионов из цитрусовых клеток и назвали это явление нуклеточной или адвентивной полиэмбрионией. Основные критерии классификации полиэмбрионии включают происхождение исходных эмбриогенных клеток, способ образования эмбрионов и генетические признаки. Исходя из клеточного происхождения эмбриогенеза, полиэмбрион можно разделить на два основных типа: гаметофитный и спорофитный. Гаметофитная полиэмбриония включает апогаметию и апосторию, в то время как спорофитная полиэмбриония включает ядерное, покровное, монозиготное расщепление и эндоспермальную полиэмбрионию ( Батыгина и Виноградова, 2007 ). За исключением последних двух, эти различные формы полиэмбрионии связаны с апомиксисом, определяемым как бесполое размножение через семена ( Савидан, 2000 ). У цитрусовых апомиктический и неапомиктический генотипы обнаруживаются в диплоидной зародышевой плазме ( Мороз и Соост, 1968 ). Есть три основных таксона, из которых произошли все культивируемые цитрусовые, а именно: pummelos [ Citrus maxima (L.) Osb.], Цитроны ( C. medica L.) и мандарины ( C. reticulata Blanco) ( Николози и соавт. 2000 ). Наиболее широко выращиваемые виды, такие как сладкие апельсины [ C. sinensis (L.) Osb.], Лимоны [ C. limon (L.) Burm f.], Грейпфруты ( C. paradisi Macf.), Липа [ C. aurantifolia ( Christm.) Swing.], Клементины ( C. clementina Hort. Ex Tan.) И сацумы [ C. unshiu (Mak.) Marc.], Произошли от скрещивания основных таксонов дерева ( Николози и соавт. 2000 ). Большинство цитрусовых генотипов апомиктичны, за исключением всех сортов цитрона, пуммело и клементина и некоторых гибридов мандарина. Случайный спорофитный зародыш является механизмом, приводящим к факультативному апомиксису в цитрусовых. Во время формирования апомиктических семян цитрусовых эмбрионы инициируются непосредственно из материнских ядерных клеток, окружающих эмбриональный мешок, содержащий развивающийся зиготический эмбрион ( Кобаяши и соавт. 1981 ). In vivo полное развитие ядер эмбрионов зависит от эндосперма, и поэтому требуется предварительное оплодотворение ( Эсен и Соост, 1977 ). Во время расширения эмбрионального мешка ядерные эмбрионы развиваются вместе с зиготическим зародышем, который может развиваться или не развиваться полностью. Большинство сеянцев, происходящих из полиэмбриональных семян, соответствуют материнскому генотипу и называются нуклееллярными сеянцами. Тем не менее, частота появления саженцев нуклеари может варьировать в зависимости от генотипа и условий окружающей среды ( Хан и Руз, 1988 ). Зиготические проростки можно отличить от их ядерных аналогов на основе изоферментов ( Иглесиас и соавт. 1974 ), случайная амплификация полиморфной ДНК ( Luro et al. 1995 ) и маркеры простого повторения последовательности (SSR) ( Руис и соавт. 2000 ). Кроме того, основной ген, связанный с апомиксисом, был недавно идентифицирован Кепиро и Руз (2010) , используя усиленные маркеры полиморфизма длины фрагмента.

Неапомиктичные цитрусовые генотипы обычно имеют только один половой зародыш на семя, хотя иногда дополнительные зародыши могут возникать либо в результате деления одной оплодотворенной яйцеклетки, либо из двух или более функциональных зародышевых мешков в одной яйцеклетке ( Мороз, 1926 ; Бакки, 1943 ; Кэмерон и Гарбер, 1968 ; Мороз и Соост, 1968 ). Мороз (1938) описали монозиготную полиэмбрионию путем расщепления полового эмбриона у гибридов с идентичным фенотипом. Впоследствии, Бакки (1943) гистологически описаны два гаметофита в одной и той же яйцеклетке грейпфрута «Фостер». Совсем недавно, проанализировав 633 гибрида корневищ цитрусовых, Medina-Filho et al. (1993) идентифицировали десять монозиготных гибридов-близнецов и две дизиготных пары с помощью анализа изозимов. Традиционно апомиктичные генотипы упоминаются как полиэмбриональные, а неапомиктичные генотипы - как моноэмбриональные, хотя эти термины могут вызывать путаницу при попытке отличить ядерный эмбрион от полового двойникования ( Кепиро и Руз, 2007 ).

Последовательное образование множественных эмбрионов в семенах неапомиктических цитрусовых генотипов наблюдалось в двух системах. В первом случае Оияма и Кобаяши (1990) сообщалось о множественных зародышах в семенах неапомикетических клементинов и мандарина 'Iyokan' ( C. iyo Hort. ex Tan.), опыленных тетраплоидом 'Kawano Natsudaidai' ( C. natsudaidai Hayata). В таких скрещиваниях получают различные типы семян, и множественные маленькие эмбрионы наблюдаются исключительно в частично развитых семенах, содержащих триплоидные эмбрионы. Точно так же мы сделали те же самые наблюдения во многих скрещиваниях 2 × × 4 в нашей программе размножения триплоидов; однако причины, лежащие в основе этого типа полиэмбрионии, остаются неизвестными. Оияма и Кобаяши (1990) проанализировали одну изоферментную систему и пришли к выводу, что все зиготические зародыши из одного семени возникли в результате расщепления исходного зиготического зародыша. Однако из-за очень ограниченного масштаба анализа этот вывод требует подтверждения, поскольку вероятность того, что полиэмбриония происходит из двух или более функциональных зародышевых мешков в одной яйцеклетке ( Бакки, 1943 ) не может быть отброшен

Второй случай касается производства эмбрионов ядрышками, выделенными из развивающихся семян и культивированных in vitro после удаления зиготического эмбриона. Эта методика была разработана с целью восстановления не патогенных ядерных клеток неапомиктичных генотипов ( Ранган и соавт. 1968 ; Эсан, 1973 ). Действительно, in vivo ядерные эмбрионы апомиктичных генотипов широко использовались в прошлом для получения растений, не содержащих вирусов, так как большинство патогенов не передаются через эмбриогенез ( Погода и Калаван, 1959 ; Ройстахер, 1979 ). Наварро и соавт. (1985) также использовал эту процедуру для восстановления без патогенов растений нескольких сортов клементина. Однако долгосрочная полевая оценка регенерированных растений показала, что их фенотип отличается от исходного растения-источника семян. В вышеупомянутом исследовании ( Наварро и соавт. 1985 ), фенотипические различия с исходными растениями были обнаружены в теплице, и когда несколько растений были извлечены из одного и того же ядра, все они были одинаковыми. Изоферментный анализ растений, продуцируемых каждым ядром, показал, что растения, регенерированные из одного и того же ядра, были идентичны, но один ядро ​​отличалось от другого и от материнского растения ( Наварро и соавт. 1985 ). Хотя считается, что эмбрионы, полученные с помощью Nucellus, культивируемых in vitro , происходят от Nucellus, их истинное происхождение остается неясным.

Настоящее исследование имеет целью ответить на следующие вопросы. (1) Систематически ли вызывает опыление родительским тетраплоидом образование полиэмбриональных семян в неапомиктичных цитрусовых генотипах? (2) Каково происхождение полиэмбрионии in vivo при скрещивании 2 × × 4 и эмбриогенезе in vitro из изолированного ядра с неапомиктичными цитрусовыми генотипами? (3) Могут ли эти два явления иметь одинаковое биологическое происхождение?

Для этого мы систематически анализировали генетическую структуру (плоидность и микросателлитную аллельную конституцию) растений, полученных из полиэмбриональных семян, возникающих в результате 2 × 4- кратных половых гибридизаций или регенерированных из культуры нцеллюса in vitro с различными неапомиктическими генотипами цитрусовых. Также были проведены гистологические исследования, чтобы попытаться определить процесс инициации полиэмбрионии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гибридизация 2 х × 4 х

Растительный материал

Неапомиктические генотипы клементина "Bruno", "Fina", "Hernandina", "Clemenules" и "Tomatera" использовались в качестве родителей-женщин. В качестве самцов использовали диплоидный мандарин «Нова» [ C. clementina × ( C. paradisi × C. tangerina )] и тетраплоидный мандарин «Нова», Tangelo «Орландо» ( C. paradisi × C. tangerina ) и сладкий апельсин «Ананас». родители. Ранее тетраплоидные родители были отобраны из проростков диплоидных сортов, которые являются двойными диплоидами в результате удвоения хромосом материнского генотипа, часто встречающегося у цитрусовых ( Ollitrault et al. , 2008 ). Все генотипы принадлежат Банку цитрусовых зародышевой плазмы Института Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA).

Опыление и спасение эмбрионов

От 50 до 150 цветов клементинов опыляли вручную с каждым родителем мужского пола. Плоды собирали в зрелом возрасте и семена экстрагировали и стерилизовали на поверхности раствором гипохлорида натрия (0,5% активного хлора) в течение 10 минут и промывали стерильной водой.

Эмбрионы выделяли из неразвитых семян в асептических условиях с помощью стереоскопического микроскопа и культивировали на чашках Петри, содержащих Мурасиге и Скуг (1962) культуральная среда с 50 г L-1 сахарозы, 500 г L-1 солодового экстракта с добавлением витаминов (100 мг L-1 мио- инозита, 1 мг L-1 пиридоксин гидрохлорида, 1 мг L-1 никотиновой кислоты, 0 · 2 мг L-1 тиамин гидрохлорид, 4 мг L-1 глицина) и 8 г L-1 Бактоагар (среда для культивирования MS). После прорастания растения переносили в 25 × 150-мм пробирки с культуральной средой MS без экстракта солода. Культуры поддерживали при 24 ± 1 ° С, влажности 60% и ежедневном воздействии в течение 16 часов при освещенности 40 мкЕ м -2 с -1.

Гибридизация 2 х × 2 х

Растительный материал

Клеменин 'Clemenules' и мандарин 'Fortune' ( C. clementina × C. tangerina ) неапомиктичные женщины-родители и Poncirus trifoliata (L.) Raf. Использовался родительский мужчина «Бенеке» из банка цитрусовых зародышей IVIA. Межродовые гибридизации цитрусовых с P. trifoliata не вызывают проблем, связанных с совместимостью, семенами, плодоношениями или растением. Кроме того, трифолатные листья P. trifoliata являются доминирующим признаком и представляют собой сильный морфологический маркер, определяющий гибридное происхождение потомства.

Опыление и нуклеточная культура in vitro

Сто цветов клементина «Clemenules» и 100 цветов мандарина «Fortune» были вручную опылены пыльцой P. trifoliata «Benecke». Плоды собирали через 13–15 недель после опыления, и ядро ​​незрелых семян иссекали в асептических условиях путем удаления как кожных покровов, так и зиготического зародыша от сердцевидной до ранней семядольной стадии развития (рис.). Только семена с семенами с хорошо видимыми зиготическими зародышами культивировали. Ядра культивируют в среде для культивирования MS, и в каждую 25 × 150-миллиметровую пробирку с культурой высевают по одному ядру с халазальным концом, встроенным в среду. Культуры содержали при 24 ± 1 ° С, влажности 60% и ежедневном воздействии в течение 16 часов при освещенности 40 мкЕ м -2 с -1. Зиготические зародыши, извлеченные из ядер, также культивировали отдельно в 25 × 150-миллиметровых культуральных пробирках, содержащих культуральную среду MS, и хранили в тех же условиях.

(A) Стадия развития семян, использованных из культуры nucellus in vitro, экстрагированных через 13–15 недель после опыления. (B) Семя с обоими кожными покровами, частично удаленными с зародышем зиготы внутри. (C, D) Ядро без кожных покровов и зиготического зародыша, выделенного на ранней семядольной стадии.

Перенос в почву

Восстановленные растения переносили в горшки, содержащие стерилизованную паром искусственную почвенную смесь, пригодную для выращивания цитрусовых (40% черного торфа, 29% кокосового волокна, 24% промытого песка и 7% перлита). Горшки были заключены в полиэтиленовые пакеты, закрыты резиновыми полосами и помещены в затененную зону теплицы с контролируемой температурой, установленной на 18–25 ° C. Через 8-10 дней мешки открывали, затем через 8-10 дней мешки удаляли и растения выращивали в обычных тепличных условиях ( Наварро и Хуарес, 2007 ).

Анализ на уровне плоидности

Уровень плоидности определяли проточной цитометрией в соответствии с методикой, описанной Aleza et al. (2009) , Каждый образец содержал небольшой кусочек листа анализируемого растения (примерно 0,5 мм2) с аналогичным кусочком листа из диплоидного контрольного растения. Образцы измельчали, используя лезвие бритвы в растворе для выделения ядер (набор ДНК высокого разрешения, тип P, раствор A; Partec, Мюнстер, Германия). Ядра фильтровали через нейлоновый фильтр 30 мкм и окрашивали раствором DAPI (4 ', 6-диамин-2-фенилиндол) (набор ДНК высокого разрешения, тип P, раствор B; Partec). После 5-минутной инкубации окрашенные образцы помещали в проточный цитометр Ploidy Analyzer (PA) (Partec), оборудованный ртутной лампой высокого давления HBO 100 Вт и комплектами фильтров KG1 и BG38. Гистограммы анализировали с использованием программного обеспечения Dpac v2 · 0 (Partec), которое определяет положение пика, коэффициент вариации (CV) и относительный индекс плоидности образцов.

Генетический анализ

Генетический анализ был проведен с использованием 13 SSR маркеров ( Kijas et al. 1997 ; Froelicher et al. , 2008 ; Luro et al. , 2008 ). Геномная ДНК была извлечена в соответствии с Деллапорта и Хикс (1983) с небольшими изменениями. ПЦР-амплификации образцов проводили с использованием Termocycler ep градиента S (Eppendorf) в конечном объеме 17 мл, содержащем 0 · 8 U Taq ДНК-полимеразы (Need), 30 нг цитрусовой ДНК, 1 · 25 мМ каждого dNTP, 5 MgCl2, 750 мм трис-HCl (pH 9), 200 мМ (NH4) 2SO4, 0,001% (об. / об.) бычьего сывороточного альбумина и 5 мкм обратные и прямые праймеры. Была применена следующая программа ПЦР: денатурация при 94 ° С в течение 5 мин; затем 35 повторов 30 с при 94 ° С, 1 мин при 50 или 55 ° С и 45 с при 72 ° С; и конечная стадия удлинения 4 мин при 72 ° С. Продукты ПЦР разделяли с помощью вертикального денатурированного электрофореза (акриламид-бис-акриламид 6%, мочевина 7 м), буфер TBE 0,5 × (Трис, кислота борная и EDTA 0,5 м, рН 8) в BioRad DCode, в соответствии с методология, описанная Froelicher et al. (2007) , Амплифицированные фрагменты были обнаружены окрашиванием серебром ( Benbouzas et al. , 2006 ).

Родительскую аллельную структуру анализировали для выбора набора праймеров для каждой родительской комбинации, чтобы различать нуклеточное и зиготическое происхождение, а также между независимым зиготическим происхождением. Результаты были обработаны с использованием кластерного анализа, основанного на коэффициенте разности костей, методом взвешенного соединения соседей. Все эти вычисления были выполнены с помощью программного обеспечения Darwin V.5 · 0 · 155 ( Perrier et al. , 2003 ; Perrier and Jacquemoud-Collet, 2006 ).

Гистологическая характеристика

Семяпочки и семена плодов, полученных из клементина «Clemenules», опыленного P. trifoliata «Benecke», собирали еженедельно после опыления и фиксировали в FAA (формальдегид, ледяная уксусная кислота и спирт 50%). Образцы были помещены в парафин, разрезаны на 10-мкм срезы и окрашены PAS (периодическая кислота-реакция Шиффа) в соответствии с общей методологией, описанной Хотчкисс (1948) , Наблюдения регистрировали с помощью микроскопа E8ip Eclipse Nikon.

ОБСУЖДЕНИЕ

SSR маркеры очень эффективны при определении происхождения эмбрионов в межвидовых скрещиваниях

Все клементины были идентичны, но важный полиморфизм был обнаружен между клементинами и всеми генотипами, используемыми в качестве родителей-мужчин. У цитрусовых маркеры SSR могут легко различать виды или сорта, возникающие в результате половой гибридизации ( Баркли и соавт. , 2006 ; Luro et al. , 2008 ). И наоборот, дифференциация генотипов, возникающих из-за спонтанных мутаций, очень трудна, как в случае с клементинами ( Брето и соавт. , 2003 ) или сладких апельсинов ( Клык и Руз, 1997 ). Используя несколько гетерозиготных маркеров, различающих мужских и женских родителей, мы также обнаружили хорошую вероятность дифференциации между независимыми зиготическими растениями.

Множественные эмбрионы, полученные в неразвитых семенах в результате гибридизации диплоидных неапомиктических цитрусовых генотипов и тетраплоидной пыльцы, являются результатом расщепления зиготического эмбриона.

Тридцать девять процентов неосвоенных семян дали более одного зародыша на семя, и генетический анализ показал, что все растения, полученные из одного и того же неразвитого семени, были идентичными и имели гибридное происхождение. Таким образом, наши результаты подтверждают предложение Оияма и Кобаяши (1990) после анализа 2 x × 4 x потомства только с одним маркером изозима. Следовательно, ясно, что эти растения возникли в результате расщепления исходного зиготического зародыша ( Бакки, 1943 ), а не наличие двух или более функциональных зародышевых мешков в одной яйцеклетке. Действительно, с выбранными маркерами вероятность обнаружения двух независимых зиготических эмбрионов с одинаковым профилем была очень низкой.

Семенная полиэмбриония неапомиктических цитрусовых генотипов специфически индуцируется путем опыления тетраплоидным мужским родителем

Мы изучили растения, регенерированные в результате 2 × 4 гибридизации с использованием трех разных тетраплоидных родителей мужского пола. Полиэмбрионы, возникающие из-за исходного зиготического эмбриона, возникали в каждом случае, устраняя влияние специфического мужского родительского генотипа и демонстрируя связь между межплоидной гибридизацией (2 × × 4) и развитием множественных эмбрионов. Кроме того, в рамках нашей программы триплоидного размножения мы провели более 50 различных гибридизаций 2 × × 4 и наблюдали присутствие нескольких эмбрионов внутри одного и того же семени во всех из них. Кроме того, в тех же самых скрещиваниях, но между двумя диплоидными родителями, полиэмбриония никогда не наблюдалась в маленьких семенах в результате оплодотворения диплоидного невосстановленного мегагаметофита гаплоидной пыльцой ( Кэмерон и Фрост, 1968 ). Кроме того, полиэмбриональные семена не наблюдались в различных скрещиваниях 2 × 4 x, выполненных в рамках нашей программы триплоидного размножения (наша неопубликованная рез.). Эти наблюдения подтверждают тот факт, что множественная продукция эмбрионов в неразвитых семенах не является следствием родительского генотипа или плоидности эмбрионов, но является следствием плоидности родительского мужского пола и, следовательно, избытка генотипа мужского родительского на уровне эндосперма или эмбриона. Эсен и Соост (1971 б , 1977 ) предположили, что при таком типе гибридизации соотношение уровня плоидности между эмбрионом и эндоспермом (3/4) порождает несовместимость между ними и аномальное развитие эндосперма с последующим недоразвитием эмбрионов. Возможно, что эти неблагоприятные условия для развития исходного зиготического эмбриона влияют на его доминирование, что позволяет производить дополнительные эмбрионы из проэмбриональных клеток, полученных из исходного зиготического эмбриона. Можно выдвинуть еще одну гипотезу, касающуюся эффекта родителя. Эффекты родительского происхождения генерируют фенотипы, которые зависят от направления скрещивания и часто происходят во время развития семян покрытосеменных, где материнское влияние является наиболее распространенным ( Аллеман и Доктор, 2000 ). Генетические механизмы могут вносить вклад в эффекты родительского происхождения во время развития семян, включая непропорциональный материнский вклад в эндосперм, пластическое и цитоплазматическое наследование, экспрессию генов в гаметофитах и ​​гаметах и ​​дифференциальную экспрессию родительских аллелей в развивающемся семени ( Дилкс и Комай, 2004 ). В интерплоидии и межвидовых скрещиваниях, протестированных на модельных организмах, таких как кукуруза и арабидопсис , генетические и фенотипические изменения, наблюдаемые у потомков, могут быть объяснены как следствие эффекта родителя.

Растения, извлеченные культурой nucellus in vitro из неапомиктических цитрусовых генотипов, представляют собой зиготические, а не ядерные растения

Генетический анализ растений, полученных из культуры nucellus in vitro, и растений, выделенных из соответствующего зиготического зародыша того же семени, показал, что все растения, полученные из культуры nucellus - клементина и мандарина «Fortune», произошли от зиготического зародыша, а не от nucellus. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что проэмбриональные клетки образуются в микропиларной области в результате первоначального расщепления зиготического эмбриона. Удаление оригинального зиготического эмбриона и культуры in vitro ядра, содержащего зиготические проэмбриогенные клетки, позволяют им завершить развитие, продуцируя эмбрионы. Гистологическое исследование развивающихся семян не выявило присутствия проэмбриональных клеток, и наблюдался только зиготический эмбрион. Только в одном случае мы нашли несколько эмбрионов, но это, вероятно, соответствовало редким случаям, когда эмбрионы-близнецы образуются in vivo ( Озсан, 1964 ; Кэмерон и Гарбер, 1968 ). Эсан (1973) провели всестороннее гистологическое исследование развития семян цитрона in vivo и получили аналогичные результаты. Эсан обнаружил только свидетельство развития зиготического зародыша и только в одном случае он наблюдал несколько проэмбрио в одном семени; однако все выжившие культуры ядерных клеток in vitro давали новые эмбрионы после удаления зиготического эмбриона. Несоблюдение предполагаемых проэмбриональных клеток в гистологическом исследовании могло быть связано с их низким уровнем дифференцировки, что не позволяет правильно идентифицировать используемые процедуры.

Полное отсутствие регенерированных растений с материнским генотипом свидетельствует о том, что нуклеточные клетки клементина и мандарина «Fortune» не обладают эмбриогенной способностью ни in vivo, ни in vitro , в отличие от нуклеточных клеток апомиктического генотипа ( Баттон и Борнман, 1971 ; Кобаяши и соавт. 1981 ).

Наши результаты для клементина и мандарина 'Fortune' согласуются с наблюдениями, сделанными для растений из неапомиктических генотипов, ранее полученных культурой nucellus in vitro . Ранган и соавт. (1968) восстановленные растения пуммело, лимона 'Ponderosa' и мандарина 'Temple' ( C. Temple Hort. ex Y. Tan.) и Эсан (1973) Восстановленные растения цитрона. Фенотипические наблюдения показали, что ни одно из растений, полученных культурой nucellus in vitro, не сохраняло материнский фенотип (CN Roistacher, Калифорнийский университет, Риверсайд, США, личный комментарий). Наварро и соавт. (1985) также регенерированные растения нескольких сортов клементина из культуры nucellus in vitro с целью получения здоровых энергичных растений nucellar. Подробная фенотипическая характеристика этих растений в теплице выявила морфологическое сходство среди растений, полученных из одного и того же ядра, но фенотипическое разнообразие между растениями, происходящими из разных ядер, тогда как большинство растений отличалось от материнских генотипов. Изоферментный анализ подтвердил фенотипические данные. Многолетняя полевая оценка растений показала, что ни один из них не сохранил материнский генотип (данные не опубликованы).

Все имеющиеся данные подтверждают наш вывод о том, что растения неапомиктических цитрусовых генотипов, продуцируемых культурой nucellus in vitro, возникают в результате соматического эмбриогенеза зиготических клеток, а не из нуклеточных клеток, как считалось ранее.

Приключенческая полиэмбриония в неапомиктичных генотипах цитрусовых

Многие покрытосеменные и голосеменные имеют потенциал для зародышевого монозиготного расщепления ( Дурзан, 2008 ). В нормальном семенном развитии хвойных обычно доминирует только один зародыш, в то время как остальные остаются неразвитыми в основании семени ( Дурзан, 2008 ). У Sequoia sempervirens и Actinostrobus acuminatus клеточные нити зиготы расслаиваются, образуя несколько эмбрионов. Распределение свободных ядер в зиготе определяет их последующую сегрегацию в зачатки новых спорофитов ( Батыгина и Виноградова, 2007 ). В Торрея , Цефалотаксус , Эфедра и Гнетум ( Йохансен, 1950 ) также возможен эмбриогенез из суспензионных клеток, и образование специальной мембраны вокруг зиготы приводит к появлению эмбрионов в Gnetum и Ephedra (Терехин, 1991, цитируется Батыгиной и Виноградовой (2007)). Потенциал расщепления полиэмбрионии у хвойных растений используется для искусственного развития семян. Монозиготное расщепление эмбрионов было описано у рода Paeonia , в котором соматические эмбрионы возникают из многоядерной клеточной структуры.

У видов, производящих моноэмбриональные семена, обычно в зрелом семени остается только один зародыш в результате конкурентного развития, в то время как другой умирает на ранних стадиях ( Батыгина, 1989 , 1998 , 2006 ). Конкуренция между эмбрионами была описана у апомиктичных цитрусовых генотипов, где зиготические эмбрионы развиваются медленнее, чем ядерные эмбрионы ( Колтунов, 1993 ). В полиэмбриональных семенах цитрусовых благоприятное развитие нуклеарных эмбрионов может быть связано с более ранним началом эмбриогенеза и конкуренцией за доступные питательные вещества ( Вакана и Уэмото, 1987 , 1988 ). В неапомиктичных генотипах цитрусовых такая конкуренция также должна объяснять различия в развитии между исходным зиготическим зародышем и случайным. Позднее начало вторичного образования зародыша может объяснить полное развитие только одного зародыша. Тем не менее, другая гипотеза может относиться к гормональному доминированию исходного зиготического эмбриона или ингибированию развития случайного эмбриона. Этот вид гормонального торможения эмбриогенеза был предложен Тиссера и Мурашиге (1977 а ) , который продемонстрировал, что наличие яйцеклеток неапомиктичного цитрона ингибирует эмбриогенетический процесс in vitro из эмбриогенного каллуса апомиктического мандарина Ponkan ( C. reticulata ). Более того, те же авторы показали, что эндогенные уровни индолуксусной кислоты, абцизиновой кислоты и гиббереллина были значительно выше в цитроне, чем в яйцеклетках мандарина ( Тиссерат и Мурашиге, 1977 год ).

Практическое значение для селекции и очистки цитрусовых

Наши выводы имеют важное значение для программ триплоидного разведения, основанных на гибридизации 2 × × 4 ( Старрантино и Рекуперо, 1981 ; Наварро и соавт. , 2002 ; Йошида и соавт. , 2003 ) поскольку на стадиях спасения зародышей от нескольких зародышей, содержащихся в неразвитых семенах, необходимо регенерировать только одно растение на семя. Это имеет огромное практическое значение, поскольку значительно снижает нагрузку на стадии in vitro и позволяет избежать дорогостоящей и длительной полевой оценки нескольких растений, принадлежащих к одному и тому же генотипу.

Более того, культура nucellus ранее считалась пригодной для получения растений, не содержащих патогенов, и методика была специально рекомендована для этой цели ( Соост и Кэмерон, 1975 ). Наши результаты ясно показывают, что с помощью неапомиктивной культуры nucellus невозможно получить растение с типом материнского генотипа. По совпадению, интерес к этой методике снизился, так как та же исследовательская группа внедрила метод прививки кончиков побегов in vitro для получения растений без патогенов без ювенильных признаков ( Наварро и соавт. 1975 ), который был принят во всем мире ( Наварро и Хуарес, 2007 ). Однако в течение последнего десятилетия гибридизация соматических клеток вызвала интерес к индукции эмбриогенных каллусных линий неапомиктичных генотипов через культуру ядер и яйцеклеток in vitro ( Ву и соавт. , 2005 ). Ясно, что точные молекулярные исследования индуцированных каллусов будут необходимы для подтверждения их материнского происхождения.

Выводы

Мы продемонстрировали, что в неапомиктичных генотипах цитрусовых эмбриогенные клетки или проэмбрио образуются в результате расщепления зиготического эмбриона. Кроме того, развитие этих случайных клеток или эмбрионов может происходить in vivo и in vitro в результате двух различных механизмов, которые предотвращают доминирование исходного зиготического эмбриона. Первый механизм включает механическое удаление доминантного зиготического эмбриона и последующую культуру in vitro ядра, тем самым способствуя развитию эмбрионов из эмбриогенных клеток, происходящих из зиготического эмбриона. Второй связан с интерплоидией 2 x × 4 x гибридизации.

Похожие

Комментарии